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张 锐1, 孙美榕2, 王润莲3, 杨燕贞3,黄燕1,杜慧1,绍陈红1,杜炳旺3﹡
(1. 广东海洋大学实验教学部现代生化中心,广东 湛江524088; 2. 深圳景江化工有限公司 广东 深圳 518057 3.广东广东海洋大学农学院,广东 湛江524088)
  摘要:采用随机引物扩增多态性DNA(RAPD)分子标记技术分析了广东海洋大学家禽育种中心的名优珍禽竞技宝官网下载苹果版鸡快羽和慢羽两个品系的12个样品鸡之间基因组DNA的遗传多样性,并进行了快羽、慢羽及其公、母间聚类分析。经3组60个随机引物扩增筛选,四种引物产生清晰稳定的多态条带;各品种间的遗传距离指数的计算结果和UPGMA聚类关系图表明:在12个样品中, 可以分成两大类群,分别为A群:4,3,11,2,12,8,5号与B群:1,6,9,10,7。在A类群中,5号和8号的遗传距离最短,0关键词:竞技宝官网下载苹果版鸡 ;快羽、慢羽基因;RAPD;遗传多样性 ;遗传分化 ;
  Study on Genetic Relationships among Princess Chickens of Rapid Feathering and Slow Feathering by RAPD Analysis
ZHANG Rui1 ,SUN MeiRong2 , Wang RunLian3, YangYanZeng3,HuangYan1,,DuHui1 ,CHengShaoHong1 ,DuBingWang3
(1. The Centre of Modern Biochemistry , GuangDong Ocean University , GuangDong ZHanJiang 524088, China; 2.SHenZhen JingJiang Industrial Co., LTD, GuangDong ShenZhen 518057, China ;
3. Agronomy Dep. of Modern Biochemistry , GuangDong Ocean University , GuangDong ZHanJiang ,524088, China; )
Abstract :The genetic diversity of genome DNA from twelve Princess Chicken in two breeds was studied by the RAPD.The map of the genetic distance between different samples and similar genetic factors and the phylogentic tree from the value of U PGMA mapping was analysed.The results showed that the twelve chicken can be divided into two groups, of which in the group A ,sample5 and sample 8 had the shortest heredity distance and closest relationship. And the same in the group B to sample1 and sample 6. Distinguishing two breeds of rapid feathering from slow feathering the and distinguishing male from female of Princess Chickens by the feather growth speed gene can provide valuable guide for molecule -breeding of chichen.
Keywords: Princess Chickens; Rapid Feathering;Slow Feathering; RAPD; Genetic Diversity;
  作者: 张 锐, 女, 1968.9~, 博士, 副教授, 主要从事生物化学与分子生物学教学与科研工作。E-mail: [email protected]
  ﹡ 通讯作者:杜炳旺, 男, 1954.9~, 教授, 主要从事家禽育种和家禽生产学教学工作。E-mail: [email protected]

  竞技宝官网下载苹果版鸡(Princess Chickens),由野生驯养而来,原产于英国,是欧洲名优特禽品种。外貌奇特,体型娇小玲珑,全身着有艳丽的黑白花羽毛,头上有一华丽毛冠,形似欧洲竞技宝官网下载苹果版的帽子,又似我国古代皇妃的凤冠,所以有“竞技宝官网下载苹果版鸡”、“贵妇鸡”“皇家鸡”之称,极具观赏价值[1]。同时竞技宝官网下载苹果版鸡肉是美味、养生、防病、治病的保健食品。
  快、慢羽是指雏鸡的羽速类型,属于羽速伴性遗传[2,3,4],以雏鸡出壳24小时内鉴别最为准确,用肉眼进行识别。快羽鸡基因型为ZkZk(♂)和ZkW(♀),表现 出雏时主翼羽长于覆主翼羽,覆主翼羽短于主翼羽或未长出;慢羽鸡基因型为ZKZK、ZKZK(♂)和ZKW(♀) ,表现为主翼羽短于或等于覆主翼羽或主翼羽未长出。将快、慢羽雏鸡带以不同翅号,只取快羽鸡留种。由于快羽是由隐性基因决定的,所以,从表型选留的快羽个体基因型都是纯的,并能稳定遗传下去[1]。杜炳旺等以竞技宝官网下载苹果版鸡为育种素材,率先在中国选育出国内外第一个竞技宝官网下载苹果版鸡自别雌雄配套系,并研究出一系列相关配套技术[5,6],从而为竞技宝官网下载苹果版鸡的研究、创新、育种、竞技宝app下载安装及开发应用赋予新的内涵,使竞技宝官网下载苹果版鸡的身价更高贵、前景更广阔、发展更具潜力。
  杂种优势大小在一定程度上取决于亲本间遗传差异的大小,因此不同品系的RAPD分析可在一定程度上反映各品系进行杂交配套的配合力[7]。在实际生产中,可选择遗传距离较远的品系进行系间杂交,以获得性状表现较为均一而生产能力又较高的杂交生产群[8]。一般在杂交组合中,由不同种性别的快、慢羽鸡的祖代进行科学的组合,使后代因性别的不同,其羽毛生长速度也不同。在育雏阶段就可以根据羽速的生长规律来鉴别雌雄。因此,利用杂种优势可以改进鸡的品质,提高其生产能力[9]。
  RAPD 标记已广泛用于动植物品系间亲缘关系、遗传距离、遗传多样性、杂种优势预测等方面的研究[11] ,在家禽的研究上,鸡的快慢羽性状(受基因K和k控制,K对k为显性)为伴性遗传,可用于自别雌雄,在养鸡生产上具有重要的指导与应用价值,且快慢羽基因除影响羽毛生长外,还与鸡的生长发育及有关生产性能有关,家禽界对它的研究和利用一直都给予很大的关注和重视[12,,13]。
  本试验运用随机扩增多态性,分析了快、慢羽两个品系竞技宝官网下载苹果版鸡间的遗传变异和亲缘关系[14] ,从而为家禽育种中进一步利用各种分子标记进行多品系间的杂交配套、配合力测定和预测杂种优势及为我国竞技宝官网下载苹果版鸡品种资源的保护和开发利用提供参考。
1、材料与方法
1.1 材料
  试验材料为竞技宝官网下载苹果版鸡,采自广东海洋大学种禽培育中心。取鸡的肝脏,清洗、标号、速冻保存。样品1~6为快羽,7~12号为慢羽;1~6号分别为♂、♀、♂、♀、♂、♀;7~12分别为♀、♂、♀、♂、♀、♂。
1.2 试剂及仪器
  试剂:购于北京鼎国生物公司的引物(3个系列K、M、P,共60条引物)、Taq聚合酶、10×buffer、4×dNTPs、λDNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker、DL15,000 Marker、DL2,000 Marker、溴化乙碇(EB)、琼脂糖、动物基因组DNA快速提取试剂盒等。RAPD引物K18 :5’CCTAGTCGAG3’,K20:5’GTGTCGCGAG3’;P11:5’ AACGCGTCGG 3’;B20:5’ GGACCCTTAC 3’
  仪器:Eppendorf-Netheler-HinzGmbH 22331HamburgPCR扩增仪、YLN-2000B凝胶影像分析系统、DYY-Ⅲ-8B稳压稳流型电泳仪、TGL16高速冷冻离心机等、756紫外分光光度计。
1.3 基因组DNA的提取及检测:
  
本实验用鼎国生物公司生产的动物基因组DNA快速提取试剂盒,将试验鸡肝脏快速提取基因组DNA。然后取5μl基因组DNA用紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度。再用1%琼脂糖凝胶后紫外透射仪上观察和凝胶影像分析系统拍照。
1.4 引物筛选及PCR扩增:
   从60个(K、P、B系列)10bp的寡聚核苷酸随机引物(北京鼎国公司)中筛选出扩增条带清晰引物用于RAPD扩增,进行DNA遗传标记和遗传图谱分析。
  PCR扩增的反应体系: ddH2O 17.1ul,10×buffer 3ul,dNTPs 2.5ul,Taq 酶 0.4U,DNA (50ng/μl) 1ul, 引物1ul,总体积 25 ul。
  PCR反应条件: 95℃预变性5min,94℃变性1min,42℃复性1min ,72℃ 延伸1min,35个循环后72℃延伸20min。 PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳和SYBR染色后,用凝胶成像系统拍照。
1.5 数据分析:电泳后的每一条RAPD谱带均为一个分子标记,并代表引物结合位点,根据分子量大小及带的有无分别记为1或0。任意两个品种间的遗传距离(Nei)与两个品种的共享度(F) 的关系如下:
F = 2 Nab / ( Na + Nb ) D = 1 - F
  其中F为共享度(相似系数),Na和Nb分别为a、b品种拥有的RAPD标记数(样品a、b所具有的扩增带数目),Nab为a、b两个品种共同拥有的RAPD 标记数。 图。
2、结果与分析
2.1 基因组DNA的检测: 将提取得到的模板DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳后紫外透射仪上观察并用凝胶影像系统拍照。拍照结果见图2-1。

图2-1.提取的基因组DNA 注:(1-12道分别是基因组1-12,13道是DL15000Marker)
2.2 引物筛选及RAPD扩增结果:筛选出的引物K18、K20、P11、B20的序列及扩增结果见表2-1。 四个引物扩增产物电泳图谱见图2-2、2-3、2-4、2-5。
表2-1所选引物扩增结果

RAPD引物

RAPD条带数

多态性条带数

变异率

K18

5~8

4

50%

K20

3~7

5

29%

P11

3~8

3

62.50%

B20

2~7

2

72%

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图2-2 K18引物对竞技宝官网下载苹果版鸡扩增电泳图谱 图2-3 K20引物对竞技宝官网下载苹果版鸡扩增电泳图谱
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图2-4 P11引物对竞技宝官网下载苹果版鸡扩增电泳图谱 图2-5 B20引物对竞技宝官网下载苹果版鸡扩增电泳图谱

  利用筛选好的4条随机引物对12个基因组进行RAPD分子标记,获得了大量的清晰且重复性好的DNA指纹图谱(图2-2,2-3,2-4,2-5)。单个引物所标记的DNA片段大小在200—2000 bp之间,每条引物对竞技宝官网下载苹果版鸡基因组扩增的DNA 条带数不同,在6-8条之间,多态性片段带数在2-3条之间(表2-1),4个引物总共扩增出30条DNA指纹带,多态性图带数为14条,多态性测率为46.62%,表明不同个体之间表现出一定的遗传多样性。
  用4条引物对模板进行扩增,其中扩增出的DNA条带中,大部分为所有品系所共有,这些条带在进化上是否属于保守系列,可否用来作为检测的分子标记,这还需要进行更深一步的研究。
2.3 快羽与慢羽竞技宝官网下载苹果版鸡间的聚类分析
  将图1、2、3、4、5中DNA条带转换成相应的数据,有DNA条带则用1表示,没有则用0表示,获得0/1距阵;再将数据通过SPSS7.0软件进行分析,可得聚类结果(表2-2)。
  从表2-2可以,5号与8号的遗传距离为0.1639,是12个样品间亲缘关系最近的,根据材料的来源,5号属于快羽系,8号属于慢羽系,但是遗传距离是最小的,是因为5号与8号样品属于雄性;同为快羽系的1号与6号样品的遗传距离为0.1894,在所有样品中,其亲缘关系仅次于5号与8号;遗传距离为0.3636的4号与8号样品为12个样品中亲缘关系最远的,因为4号为快羽系雌性鸡,而8号为慢羽系雄性鸡。
表2-2.不同样品间的遗传距离


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

2

0.3800

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

0.1819

0.3704

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4

0.1856

0.3272

0.2982

 

 

 

 

 

 

 

 

5

0.1818

0.3504

0.2857

0.2982

 

 

 

 

 

 

 

6

0.1894

0.2308

0.1951

0.2143

0.2195

 

 

 

 

 

 

7

0.2093

0.3396

0.3091

0.3214

0.3273

0.2750

 

 

 

 

 

8

0.1905

0.3269

0.3148

0.3636

0.1639*

0.2308

0.4151

 

 

 

 

9

0.1579

0.3542

0.3000

0.3725

0.3400

0.2571

0.3469

0.3125

 

 

 

10

0.1750

0.2800

0.2885

0.283

0.3462

0.2703

0.3529

0.3000

0.1765

 

 

11

0.1707

0.3137

0.2642

0.3519

0.3396

0.2632

0.3546

0.3525

0.2978

0.3061

 

12

0.1905

0.3654

0.3148

0.3455

0.3704

0.2308

0.3585

0.3462

0.3333

0.3000

0.3520

  从上结果可见,快、慢羽之间的亲缘关系比较远,两个品系之间存在着比较明显的遗传差异。快、慢羽之外,所取的样品在雌雄之间,也出现了一定的遗传差异。
由遗传距离生成的聚类分析树形图(图2-6),显示出可表达样品间的遗传距离差异的等级,距离越大,差异越大,等级越明显。12个样品大体上可以分为两个类群,第一个类群中大部分属于快羽系,第二个类群大部分为慢羽系;两个类群的遗传距离约22。 第一个类群中,1、3、4、5号均为快羽系,8号与12号虽为慢羽系,但是因为同属雄性鸡,所以5号与8号样品的亲缘关系最近;对于11号样品,属于慢羽系的雌性鸡,与2号快羽系雌性鸡有比较近的遗传关系。第二个类群中,7、9、10号样品均属于慢羽系, 其中1号与6号样品同属快羽系,所以其亲缘关系较近。
3. 讨论
3.1 RAPD扩增及聚类分析
  本试验建立了竞技宝官网下载苹果版鸡基因组DNA的提取方法和RAPD-PCR实验技术体系,并对12个样品竞技宝官网下载苹果版鸡的DNA多态性进行了初步分析, 基本反映了它们之间真实的遗传关系。试验结果可见,每个引物对十二个实验样品RAPD扩增的条带总数与变异条带数及变异率不同,变异率最大的达72%(引物B20),说明试验用的竞技宝官网下载苹果版鸡之间存在较丰富的遗传多样性,体现了竞技宝官网下载苹果版鸡品系基因组DNA之间存在显著的差异性,反映了广东海洋大学种禽培育中心的种质资源基因库是极为丰富的。试验所得的竞技宝官网下载苹果版鸡个体间遗传距离从0.1818~0.3846不等。可见,由快慢羽杂交配合体系杂交出来的个体与品系间都存在着遗传差异,并有丰富的遗传多样性,意味着较大的进化潜能及较丰富的育种和遗传改良的潜力。

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图2-6 竞技宝官网下载苹果版鸡DNA聚类分析树形图 注:(1~6号样品均属快羽系,分别为♂、♀、♂、♀、♂、♀;
7~12号样品均属慢羽系,分别为♀、♂、♀、♂、♀、♂)

  所研究的12个样品竞技宝官网下载苹果版鸡中,DNA显现一定的多态性,存在着不同程度的遗传分化。相同的地理环境,相同的饲养条件,竞技宝官网下载苹果版鸡面对着相差不大的环境选择压力,但个体间还是存在着明显的遗传分化,究其因可能是:首先竞技宝官网下载苹果版鸡本身基因组DNA容易发生遗传突变,进化速度快;其次竞技宝官网下载苹果版鸡种群间存在着强的基因流;竞技宝官网下载苹果版鸡种群对外界环境压力敏感,即稍小的环境差异,也会对其造成选择压力,以致造成个体间的不同分化;最后国内引进的竞技宝官网下载苹果版鸡鸡种源不一、纯度不同、遗传结构较为丰富。
3..2 RAPD技术在家禽遗传关系研究中出现的问题与解决方案:
  近年来,对利用DNA分子标记估测,以研究动物种群间的遗传关系和起源进化的历史已有较多的报道。其中RAPD标记以其多位点性和实验操作简便快捷而被越来越多的研究者所采用[15,16,17]。
  RAPD技术是家禽分子遗传育种中一种比较理想的分子遗传标记方法,但在目前的应用中也存在一定的不足,首先是绝大多数RAPD标记为显性,遵从孟德尔遗传,难以在F1代中区分开纯合子和杂合子的基因型,需要进一步的检测;无法知道扩增出来的RAPD片段的分子基础,即其在基因组中的确切位置和功能。其次是检测结果稳定性和可比性差。对于同一份材料及使用同一引物,实验条件的微小改变,合成的带谱也可能会有出入,即不同实验室之间很难重复。再次,对模板的纯度要求较高。模板稍有不纯,就会出现种种非特异性带及终止等现象,使扩增反应失败;因为引物是随机的,所以可能对大量的引物进行筛选,有时甚至要筛选500-800个以上的引物。对于世代较长或群体数目较少的动物,要找到近等基因系以形成品种(系)的特征标记比较困难。最后是分析成本大,PCR扩增产物在检测过程中,常出现影子带和波峰重叠现象,给等位基因的判读带来困难,使研究结果产生偏差。
  但是,RAPD技术的不足可以通过增大样本、精密设计、规范反应条件和细心操作来加以克服,所以,需要做进一步的研究与改进。
3.3快、慢羽竞技宝官网下载苹果版鸡的研究意义
  自Serebrovsky(1922) 首次报道了鸡的羽速基因后,许多学者对羽速基因进行了大量的研究,发现快、慢羽基因是位于性染色体上的一对等位基因,慢羽对快羽为显性。很多研究结果表明,羽速基因不仅控制鸡的羽毛生长速度,还能影响鸡的某些器官以及整个身体的生长发育和鸡的一些经济性状[18]。
  雏鸡雌雄鉴别有人工鉴别的方法,也有伴性遗传自别雌雄的方法,人工翻肛鉴别有许多不足之处,会造成对雏鸡的应激和疾病的传播、挤伤雏鸡等。而根据竞技宝官网下载苹果版鸡的特点,最理想的方法是利用羽速基因的伴性遗传原理,实行初生雏鸡自别雌雄。因为鸡的快慢羽性状(受基因K和k控制,K对k为显性)由羽速基因决定,属于伴性遗传,可用于自别雌雄,利用羽速基因鉴别雌雄具有速度快、准确率高、成本低、效益高、可防止疾病传染、简单易学易推广等特点,在养鸡生产上具有重要的指导与应用价值。

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新闻录入:湛江市晋盛牧业科技有限公司 更新时间:2011-7-28 18:33:11

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